LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA
MOLEKULER
Nama : Aris Setyawan
ISOLASI DNA PLASMID
LATAR
BELAKANG
Rekayasa
genetika merupakan perkembangan ilmu biologi yang sangat pesat. Dalam
penggunaannya rekayasa genetika salah satunya yaitu dimanfaatkan untuk
memproduksi penisilin menggunakan sel
plasmid. Selain itu rekayasa genetika juga digunakan untuk memproduksi
antibiotik dan obat untuk mengatasi dampak masalah kesehatan manusia yang
semakin lama semakin menurun. Akan tetapi dalam prosesnya masih terdapat
kesalahan. Untuk itu diperlukan metode analisis dalam mengembangkan ilmu
rekayasa genetika secara tepat, sehingga didapatkan hasil yang lebih maksimal
(Muladno 2002). Tujuan praktikum ini adalah mengisolasi plasmid dan fragmen DNA
tunggal dari fragmen DNA yang lainnya, serta melakukan pemotongan DNA
menggunakan enzim restriksi.
TINJAUAN
PUSTAKA
Plasmid
adalah bagian penyusun dari DNA berbentuk lingkaran atau sirkuler yang memiliki
kemampuan untuk bereplikasi secara sendiri (autonom). Plasmid biasanya dimiliki
oleh prokariot dan bakteri tertentu, yang tidak mutlak diperlukan bagi
kelangsungan hidupnya. Plasmid dapat digunakan untuk membuat DNA rekombinan, yang
melibatkan proses hibridisasi dan elusi. Hibridisasi adalah proses kloning atau
perbanyakan DNA, sedangkan elusi adalah proses pemisahan fragmen DNA yang
terikat pada membran sel. Fragmen DNA tersebut akan dipisahkan dengan komponen
penyusun sel lainnya, sehingga di dapat DNA murni yang tidak tercampur dengan
komponen pengotor DNA (Pingoud 2001).
Plasmid
SL 16 adalah salah satu dari beberapa jenis plasmid yang memiliki sifat dapat
di sisipkan ke plasmid lain yang mengalami proses pemotongan. Plasmid ini berukuran
lebih kecil dari plasmid yang akan disisipi. Untuk mengisolasi plasmid dari DNA
dapat dilakukan dengan mendegradasi dinding sel dan pemisahan komponen plasmid
dari komponen sel yang lainnya, serta dilanjutkan dengan pemotongan fragmen DNA
menggunakan enzim restriksi. Terdapat dua jenis enzim restriksi yaitu enzim
restriksi endonuklease dan enzim restriksi eksonuklease. Enzim restriksi
endonuklease apabila memotong sekuen DNA maka akan menghasilkan potongan
fragmen DNA berujung lancip. Sedangkan enzim resriksi eksonuklease adalah enzim
yang memotong sekuen DNA akan menghasilkan potongan fragmen DNA berujung
tumpul. EcoR1 merupakan salah satu enzim restriksi endonuklease. EcoR1 dsapat
mengenali situs khusus pada suatuy sekuen DNA yang nantinya akan dipotong
olehnya (Rusli 2006).
HASIL
PENGAMATAN
Tabel 1 Hasil
spektrometer plasmid pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
|
Sumur
|
OD260
|
OD280
|
Kemurnian DNA
|
Konsentrasi DNA (ng/µl)
|
|
1
|
0,220
|
0,115
|
1,913
|
3,080
|
|
2
|
0,298
|
0,158
|
1,886
|
4,172
|
|
3
|
0,988
|
0,526
|
1,878
|
13,832
|
|
4
|
0,176
|
0,094
|
1,872
|
2,464
|
|
5
|
0,927
|
0,496
|
1,869
|
12,978
|
|
6
|
0,577
|
0,296
|
1,949
|
8,078
|
|
7
|
0,612
|
0,325
|
1,883
|
8,568
|
|
8
|
0,314
|
0,166
|
1,892
|
4,396
|
|
9
|
0,364
|
0,189
|
1,926
|
5,096
|
|
10
|
0,369
|
0,203
|
1,818
|
5,166
|
|
11
|
0,452
|
0,245
|
1,735
|
6,328
|
Contoh perhitungan konsentrasi DNA
:
Panjang gelombang yang digunakan adalah
260 nm, setara dengan 50 μg/ml DNA atau 40 μg/ml RNA. Ada tidaknya DNA dihitung
dengan cara :
OD260/OD280 = 1,949 (contoh perhitungan pada sumur 6)
Hasil
spektrofotometer dikatakan mengandung DNA murni jika OD260/OD280 > 1,8. Hasil menunjukkan nilai 1,949 yang
artinya pada sumur 6 mengandung DNA
murni.
Konsentrasi
DNA dihitung dengan cara :
Faktor
pengenceran = 700 μl, karena 5 μl DNA diencerkan hingga
700 μl. Pengenceran dilakukan sebanyak 2 kali sehingga :
Konsentrasi
DNA (6) = OD260 x 50 μg/ml
x faktor pengenceran x 2
=
0,577 x 50 μg/ml x (700/50) μl x 2
=
8078 μg/ml = 8,078 ng/µl
Pengamatan isolasi DNA
plasmid dengan menggunakan spektrofotometer, pada kelompok 6 berhasil
mendapatkan DNA yang murni. DNA dianggap murni apabila memiliki perbandingan OD260/OD280
= 1.8-2.0 (Campbell 2002). Hasil DNA kelompok 6 memiliki selisih perhitungan OD260/OD280
sebesar 1.949 (>1.8), sehingga DNA kelompok 6 dapat dikatakan sudah murni. Kemurnian
DNA juga didapat oleh kelompok 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, dan 10 dengan hasil dari
perhitungan OD260/OD280 sekitar 1.8-2.0. Sedangkan pada
kelompok 11 belum mendapatkan DNA murni, karena hasil OD260/OD280
sebesar 1.735. Hasil pemotongan DNA plasmid kelompok 6 menggunakan enzim
restriksi yaitu adanya pita yang sejajar dengan pita vektor dan insert dalam sumur
kontrol, tetapi tidak terbentuk potongan DNA plasmid. Hal ini menunjukkan bahwa
DNA plasmid kelompok 6 belum terpotong oleh enzim restriksi. Kelompok yang
berhasil mendapatkan potongan pita DNA plasmid yaitu kelompok 1 yang
ditunjukkan dengan terbentuknya 3 pita. Pita ke-1 sejajar vektor, pita ke-2
sejajar dengan insert, dan pita ke-3 dibawah insert yang menunjukkan DNA
plasmid berhasil terpotong. Kelompok 6 tidak berhasil mendapatkan potongan DNA
plasmid dikarenakan pada saat running, loading dye tidak dimasukkan ke dalam sumur.
Isolasi fragmen DNA plasmid menggunakan teknik Elusi dari
gel agarosa bertujuan untuk memisahkan fragmen DNA plasmid yang ingin dipakai
dengan komponen-komponen penyusun sel yang lainnya. Hasil elusi
pada kelompok 6 (sumur 8) menunjukan terbentuknya pita yang merupakan fragmen tunggal DNA plasmid yang digunakan. Hal ini menunjukkan
bahwa kelompok 6 berhasil melakukan proses elusi fragmen DNA plasmid dengan
elektroforesis pada gel agarosa. Hasil yang sama juga didapat oleh kelompok 3
(sumur 5) yang ditandai dengan terbentuknya pita
pada gel agarose. Sedangkan pada kelompok yang lainya (1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10,
11) belum berhasil melakukan proses elusi fragmen DNA plasmid, karena pada
sumur gel agarose masing-masing kelompok tidak terbentuk pita DNA.
SIMPULAN
Spektofotometer
digunakan untuk mengamati DNA plasmid pada gel agarose. Hasil dari spektrofotometer DNA plasmid kelompok 1-10 berhasil mendapatkan DNA plasmid yang murni, sedangkan kelompok 11 tidak
berhasil mendapatkan DNA plasmid yang murni. Hal ini ditunjukkan dengan tingkat kemurnian DNA kelompok 1-10 sekitar 1.8 – 2.0, sedangkan kelompok 11 adalah 1.735. Pemotongan DNA plasmid yang dilakukan oleh kelompok 6 dengan enzim
restriksi plasmid SL16 dan EcoRI, menunjukkan terpotongnya plasmid yang
ditunjukkan dengan terbentuk pita pada saat running. Elusi
fragmen DNA plasmid pada kelompok 4 belum berhasil, karena tidak adanya fragmen
tunggal pada gel agarosa.
DAFTAR
PUSTAKA
Campbell
NA. 2002. Biologi Jilid 1. Jakarta (ID): Erlangga.
Muladno.
2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor (ID): Pustaka Wirausaha Muda.
Rusli
F. 2006. Screening Awal Enzim Endonuklease Restriksi Spesifik dari Bakteri.
[Skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Teknologi Pertanian, IPB.
Pingoud A, Jeltsch A. 2001. Structure and function of
type II restriction endonucleases. Nucleic Acids Res 29(18): 3705-27.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar